Tři fáze objevu signální molekuly NO
Přes sto let trvalo, než se objasnilo, proč nitroglycerin zmírňuje srdeční bolesti – že uvolňuje oxid dusnatý, který vyvolá rozšíření koronárního řečiště.
Oxid dusnatý je jednou z deseti nejmenších molekul mezi stovkami milionů molekul, které se v přírodě vyskytují. Je to molekula velice nestabilní, takže se po svém vzniku během několika sekund změní na nitrát nebo nitrit. Jak vlastně výzkum biologických účinků NO začal?
- Ferid Murad se zabýval příčinami vazodilatačního efektu nitroglycerinu a jeho derivátů. R. 1977 objasnil, že se z těchto látek uvolňuje NO, který vyvolává relaxaci hladkého svalstva.
- R. F. Furgott s Johnem Zawadskim v Downstate Medical Center v Brooklynu r. 1980 experimentovali s vazodilatačními látkami, které rozšiřují průsvit cév. Zjistili, že účinek těchto látek mizí, když se cévní stěna mechanicky zbaví vnitřní výstelky – endotelu. Tento výsledek znamenal, že vazodilatační látky (především acetylcholin) nepůsobí relaxačně přímo na svalstvo cév, nýbrž prostřednictvím nějakého faktoru, vázaného právě na buňky cévního endotelu. Furgott se Zawadskim došli k závěru, že tyto buňky produkují endoteliální relaxační faktor (EDRF) neznámé povahy.
- L. J. Ignarro po rozsáhlé analytické práci r. 1986 usoudil, že onen neznámý faktor je shodný s oxidem dusnatým, který v dané reakci funguje jako signální molekula mezi endotelovou buňkou a buňkou hladkého svalu cév.
Později byl odhalen také fyziologický enzymatický mechanismus vzniku i likvidace molekuly NO. Na tvorbě endogenního oxidu dusnatého, který je konečným produktem konverze L-argininu na L-citrulin, se podílí jako biologický katalyzátor speciální enzym NO-syntáza.
Využití objevu ve fyziologii
Objev vyprovokoval kaskádu výzkumných prací, v nichž se mnohostranná signální úloha NO v mezibuněčném přenosu informací dodnes blíže objasňuje. Česká pracoviště, jak akademická, tak univerzitní, tento výzkumný trend zachytila velice brzy. Není snad oblasti fyziologie a medicíny, v níž by nebyla identifikována stopa účasti NO v komunikačních procesech organizmu. Dnešní badatelský zájem o molekulu NO je zaměřen především na kardiovaskulární systém – se zvláštním zřetelem na regulaci krevního tlaku, na imunitní systém a mechanismus zánětu, a konečně na centrální nervový systém.
Každá z těchto oblastí představuje soubor problémů. Vliv NO na hladké svalstvo znamená regulační zásahy do funkce cév, do motoriky dýchacích cest či do složitých pohybových pochodů v gastrointestinálním systému a urogenitální soustavě.
Podobně účinek NO na jeden funkční ukazatel (např. na krevní tlak) znamená zásah nejen do srdeční a cévní činnosti, ale i do funkce ledvin.
Při pátrání po úloze NO ve funkcích centrálního nervového systému jde o dva základní problémy: o úlohu NO v reakcích centrálních neuronů na excitační aminokyseliny a o úlohu NO v glutamátové neurotoxicitě. Při neurotoxickém poškození nervových buněk excitačními aminokyselinami během nedostatku kyslíku a při neuronální degeneraci rozbíhá sérii těchto dějů právě oxid dusnatý.
Zkoumání úlohy NO posunuje jednotlivé obory o krok kupředu. Zmiňme se alespoň o tom, že objev signálního významu NO vyvolal v badatelských kruzích zájem o další možné kandidáty. Dnes se uvažuje o signálním významu oxidu uhelnatého nebo kyseliny arachidonové. Ve všech třech případech jde o nový typ komunikace a přenosu informací v biologických systémech, podstatně odlišný od dosud známých kategorií biologických působků typu hormonů, neurotransmiterů a neuromodulátorů.
Nobelova cena za medicínu 1998 tedy nebyla udělena jen proto, že se jedna kapitola vývoje vědy uzavřela, ale také proto, že objev fyziologické úlohy oxidu dusnatého otevřel nové možnosti výzkumu.
Suplementace argininu byla identifikována jako výhodná při experimentálním hojení ran. Mechanismy, které jsou základem tohoto příznivého účinku při opravě tkáně, však zůstávají nevyřešeny. Studie na zvířatech naznačují, že prospěšná role doplňování argininu je zprostředkována, alespoň částečně, prostřednictvím NO. Posledně jmenovaná složka zprostředkovává procesy zapojené do opravy tkáně, včetně angiogeneze, epitelizace a tvorby kolagenu. Tato prospektivní studie se provádí za účelem zkoumání metabolismu argininu u akutních chirurgických ran u člověka. Exprese enzymů, o kterých je známo, že se podílejí na metabolismu argininu, byla studována na dárcovských místech kožních štěpů 10 hospitalizovaných pacientů podstupujících transplantaci kůže. Hladiny metabolitů argininu v plazmě a v ráně (ornithin, citrulin, nitrát a dusitan = NOx) byly měřeny pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Exprese iNOS, eNOS, arginázy-1 a arginázy-2 byla studována imunohistochemicky v parafinových řezech kožní tkáně. Koncentrace arginázy-1 byla měřena v plazmě a tekutině z rány pomocí ELISA. Argináza-2 byla stanovena pomocí analýzy Western blot. Pozorovali jsme zvýšené hladiny citrulinu, ornithinu, NOx a arginázy-1 v tekutině rány ve srovnání s plazmou. Argináza-2 byla exprimována jak v plazmě, tak v tekutině z rány a zdálo se, že je vyšší v plazmě. iNOS byl exprimován neutrofily, makrofágy, fibroblasty, keratinocyty a endoteliálními buňkami po poranění, zatímco reaktivita eNOS byla pozorována v endoteliálních buňkách a fibroblastech. Argináza-1 byla exprimována v neutrofilech po poranění, zatímco barvení arginázou-2 bylo pozorováno v endoteliálních buňkách, keratinocytech, fibroblastech, makrofázích a neutrofilech. Poprvé data na lidech podporují předchozí studie na zvířatech naznačující metabolismus argininu pro reparaci poraněné kůže zprostředkovanou NO i arginázou.
Moderní pokroky v nutričních terapiích vedly ke specifickému použití suplementace argininem pro syntézu proteinů, buněčnou signalizaci prostřednictvím produkce oxidu dusnatého a buněčnou proliferaci prostřednictvím jeho metabolismu na ornitin a polyaminy. Arginin je klasifikován jako neesenciální aminokyselina, která se stává podmíněně nezbytným substrátem u stresovaných dospělých. Bylo prokázáno, že arginin zvyšuje pevnost ran a ukládání kolagenu v umělých řezných ranách u hlodavců a lidí. Role dietní intervence ve formě suplementace argininu byla navržena pro normalizaci nebo zlepšení hojení ran u lidí. Ačkoli je tato hypotéza často diskutována, terapeutický účinek suplementace argininem na hojení chronických ran u lidí stále není určen a vyžaduje další objektivní důkazy. Jsou vyžadovány dobře navržené klinické studie, aby se zjistilo, zda je suplementace argininem účinná při zlepšování hojení akutních a chronických ran u lidí a jaké množství argininu se doporučuje ke splnění metabolických potřeb během fází hojení ran.
Byla zkoumána produkce oxidu dusnatého (NO) a toky volných aminokyselin na straně rány během prvních 3 dnů po kožní ráně. Experimenty byly provedeny na krysách Albino Oxford (n=18), kterým byla implantována do kůže polyvinylová houba. Intaktní zvířata (n=6) byla kontrola. Dusitany, dusičnany, volné aminokyseliny a močovina byly měřeny jak v plazmě, tak v tekutinách ran. Rovněž byly analyzovány exprese indukovatelného genu syntázy oxidu dusnatého (iNOS) v místě poranění. Nejvyšší hladiny jak exprese genu iNOS, tak jeho aktivity (zvýšený citrulin a dusitany v ráně) byly první den. Dusičnany z rány byly významně nad plazmatickými hladinami po celou dobu, zatímco molární poměr dusičnanů k dusitanům se neustále zvyšoval. Bylo to spojeno s postupným nárůstem jak ornithinu, tak urey, stejně jako se stálým poklesem argininu a zvýšením fenylalaninu v místě rány. Postupný pokles molárního poměru glycinu k rozvětvenému řetězci byl pozorován jak v plazmě, tak v tekutinách z rány. Závěrem lze říci, že časné lokálně vyvolané změny v metabolismu Arg v důsledku zvýšené tvorby NO následované zvýšenou aktivitou arginázy způsobují relativní nedostatek Arg v místě rány a narušují nutriční stav celého těla téměř během časného období hojení po kožní ráně u potkanů. . Je pravděpodobné, že autooxidace NO na straně rány je ovlivněna dostupností substrátu.
Oxid dusnatý (NO) byl navržen jako patofyziologický modulátor buněčné proliferace, zástavy buněčného cyklu a apoptózy. V této souvislosti může NO vykazovat opačné účinky za různých podmínek. Několik studií skutečně ukázalo, že nízké relativní koncentrace NO zřejmě podporují buněčnou proliferaci a antiapoptotické reakce a vyšší hladiny NO podporují dráhy indukující zástavu buněčného cyklu, mitochondriální dýchání, stárnutí nebo apoptózu. Zde uvádíme účinky NO na podporu i inhibici buněčné proliferace, zejména s ohledem na kardiovaskulární onemocnění, diabetes a kmenové buňky. Kromě toho se zaměřujeme na molekulární mechanismy účinku zapojené do řízení progrese buněčného cyklu, které zahrnují jak dráhy závislé na cyklickém guanosinmonofosfátu, tak i nezávislé. Toto rostoucí pole může vést k širokým a novým cíleným terapiím proti kardiovaskulárním onemocněním, zejména souběžnému diabetu 2. typu, stejně jako k novým diagnostickým nástrojům založeným na biozobrazování NO.